Introducción a las reacciones de la oscuridad

 (Ciencias de Joseleg)(Biología)(Introducción y biología celular)(La fotosíntesis) (Introducción)(Generalidades de la fotosíntesis)(Física de la fotosíntesis)(Destino de los átomos en la fotosíntesis)(Reacciones de la luz 1, la oxidación del agua)(Reacciones de la luz 2, Cadena de transporte de electrones y fosforilación)(Introducción a las reacciones de la oscuridad)(Etapa de fijación de carbono en las plantas C3)(Etapa de fijación de carbono en las plantas CAM y C4)(Etapa de regeneración de la RuBP)(Etapa de síntesis de carbohidratos)(Evolución de la fotosíntesis)(Referencias bibliográficas)(Versión documento word)

Ahora, iniciemos por lo básico. Las plantas no derivan los materiales para incrementar su peso de la tierra, sino del aire. De la tierra obtienen minerales importantes, pero que solo representan fracciones insignificantes de sus propios pesos, el resto proveniente de otra fuente que no es otra que el aire. El primero en puntualizar este detalle fue Jan Baptist van Helmont (1580-1644). Van Helmont fue un hombre de contradicciones a nuestros ojos, pero definitivamente recoge el significado completo de un ilustrado del renacimiento. Donde se amalgaman el mundo moderno y el antiguo, místico, alquimista y experimentador. Independientemente de sus investigaciones en alquimia o sus creencias místicas, Van Hemont al igual que otros ilustrados es recordado únicamente por sus contribuciones experimentales.

Figura 17. Jan Baptista van Helmont, (nacido el 12 de enero de 1580 [1579, estilo antiguo], Bruselas [Bélgica] - fallecido el 30 de diciembre de 1644, Vilvoorde, Países Bajos españoles [Bélgica]), médico, filósofo, místico y químico flamenco que reconoció la existencia de gases discretos y dióxido de carbono identificado.

Uno de los más importantes y que nos introduce al estudio de la fijación de carbono por parte de las plantas fue el realizado al hacer crecer plantas de sauce en el interior de recipientes con cantidades de tierra medidas mediante el peso.  Adicionalmente, adicionó a sus cálculos el peso del agua que debía agregar a los recipientes durante años. Después de cinco años las plantas ganaron 74 kg independientes de la masa de la tierra, sin embargo, originalmente él pensó que la ganancia de masa se debía al agua  únicamente. Sin embargo, Stephen Hales (1677-1761) determinó que las hojas realizaban transpiración, perdiendo agua en el proceso. En otras palabras, ni el agua ni el suelo eran la fuente de la ganancia de peso de las plantas. El mismo Hales en su libro titulado “Vegetable Staticks” describe experimentos en los que demuestra que es el aire que ingresa a las plantas la fuente principal de nutrición, y que este podía ingresar a la planta no solo por las raíces, sino por el tallo y las hojas.

Figura 18. Stephen Hales (17 de septiembre de 1677 – 4 de enero de 1761) fue un clérigo inglés que hizo importantes contribuciones en varios campos científicos como la medicina, fisiología, química y botánica. Hales estudió el papel del aire y el agua en el mantenimiento de la vida animal y vegetal. Dio los primeros registros del movimiento del agua en las plantas y demostró que las plantas absorben aire. Hales descubrió los peligros de respirar aire viciado e inventó un ventilador que mejoraba los índices de supervivencia de los trabajadores de barcos, hospitales y prisiones. También se le reputa avances en los sistemas de recolección de gases.

Sin embargo, debió pasarse por los experimentos que diferenciaron el contenido del aire en sustancias individuales para poder identificar qué tipo de aire ingresaba y salía de la planta. Ya para el siglo XX era evidente que dos gases de importancia metabólica eran los protagonistas de la historia, el oxígeno y el dióxido de carbono. En la serie de artículos sobre las reacciones lumínicas vimos cómo es que el oxígeno es producido mediante la oxidación de dos moléculas de agua por parte del fotosistema II. Ahora nos enfocaremos en como el dióxido de carbono ingresa y es convertido a moléculas orgánicas de alto peso molecular, proceso al cual se le denomina fijación de carbono.

Estudiando la fijación de carbono

 Después de la Segunda Guerra Mundial, Melvin Calvin de la Univeridad de California, Berkeley junto con sus colegas Andrew Benson y James Bassham, iniciaron lo que se convertiría en un estudio de una década a cerca de reacciones enzimáticas que permiten a las células asimilar el dióxido de carbono y convertido en biomasa.

Figura 19. Montaje experimental y resultados de la cromatrografía en papel, el carbono-14 sirve como marcador para identificar las sustancias en las cuales se va integrando paulatinamente.

Armados con el nuevo isótopo de carbono-14 y una nueva técnica llamada cromatografía bidimensional en papel, ellos comenzaron la tarea de identificar todas las moléculas marcadas producidas por la célula vegetal cuando absorbía carbono atmosférico “Dióxido de carbono catorce ”. Los estudios comenzaron con hojas de plantas, pero rápidamente se cambiaron un modelo más simple y de crecimiento más rápido, el alga verde Chlorella spp. Los cultivos de algas crecían en cámaras cerradas en la presencia de dióxido de carbono doce “el normal”, y posteriormente, el dióxido de carbono catorce era inyectado en el cultivo. Después de cierto periodo de tiempo, la suspensión era secada en un contenedor de alcohol caliente, el cual tiene los efectos combinados de matar la célula, detener a las enzimas y extraer las moléculas solubles en alcohol.

Los extractos de células eran posteriormente posicionados en el papel de cromatografía y sometidos al procedimiento de identificación. Los resultados experimentales llevados a cabo por años en la década de 1950 dieron como resultado lo que actualmente es denominado el ciclo Kalvin-Benson, ciclo de Kalvin, fase oscura o reacciones de la oscuridad de la fotosíntesis (Bassham, Benson, & Calvin, 1950; Bassham et al., 1954; A A Benson et al., 1950; Andrew A Benson et al., 1952; Biel & Fomina, 2015; Calvin et al., 1950; Schou, Benson, Bassham, & Calvin, 1950).

Los experimentos de Calvin y colaboradores permitieron determinar que las plantas eran capaces de fijar carbono muy rápido. Si el periodo de tiempo de incubación era muy corto “algunos segundos”, se generaba una marcha radioactiva en el revelado de la cromatografía, dando un compuesto identificado previamente como 3-fosfogliceraldehído “ ” que es uno de los intermediarios de la glucólisis. El grupo de Calvin sospechaba que el dióxido de carbono era unido de manera covalente a un compuesto de dos carbonos para formar el . Debido a que el primer compuesto en ser identificado fue una molécula de tres carbonos, las plantas que emplean este mecanismo son denominadas como plantas C₃.

Cuando el tiempo de incubación se prologó otras manchas fueron apareciendo e identificando, esto gracias a la presencia de los carbonos marcados de manera radioactiva. Pronto pareció evidente que el proceso de fijación del carbono era cíclico “o cuasi cíclico” y bastante complejo. Esta ruta metabólica ha venido a denominarse históricamente como el ciclo de Calvin “o ciclo de Calvin Benson”, y ocurre en todos los organismos con fotosíntesis del tipo II “fotosistema I + fotosistema II”. Las bacterias verdes sulfurosas que hacen uso la fotosíntesis del tipo I “fotosistema I” emplean un ciclo distinto llamado ciclo del 3-hidroxipropionato.

Fases generales del ciclo de Calvin

El ciclo de Calvin es un cuasi-ciclo, es decir, no siempre se completará como ciclo. En esencia de una ruta metabólica bifurcada en un punto de desviación, en el punto de desviación puede o completar el ciclo, o sintetizar azúcares. Históricamente al ciclo de Calvin se lo ha dividido en tres partes:

La fijación de carbono

En esta etapa se emplea una molécula de 5 carbonos que actúa como fijador, se denomina Ribulosa-1,5-bifosfato, tambien llamada RuBP para acortar. RuBP captura una molécula de CO₂, Para formar un intermediario de 6 carbonos, muy inestable, el cual recibe energía proveniente de las reacciones lumínicas, para formar dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato o GAP cada una de 3 carbonos. La sustancia GAP es el producto más importante, pues él puede emplearse ya sea para regenerar el ciclo o para fabricar azúcar. Tenga en cuenta que en dos moléculas de GAP solo se ha fijado un carbono externo, por lo que para fijar varios carbonos debemos iniciar el ciclo de Calvin varias veces.

Figura 20. El ciclo de Calvin consta de tres etapas, las primeras dos, fijación y reducción son las más representadas en los libros de texto.

Regeneración del ciclo

A partir del GAP pueden hacerse sucesivas y complejas transformaciones para producir nuevamente la RuBP, evidentemente esto requiere fusionar varias moléculas de GAP, así que para producir 6 moléculas de RuBP se necesitan al menos 10 moléculas de GAP, y por ende, se requiere que el ciclo de Calvin se inicie como mínimo 5 veces. Pero de los 15 carbonos involucrados, solo 5 son carbonos nuevos fijados de la atmósfera, mientras que los otros 10 provienen de la propia planta. Por ende, se puede decir que para generar una sola RuBP completamente nueva, se requiere que el ciclo inicie 5 veces.

Síntesis de azúcares

El ciclo de Calvin no es realmente un ciclo debido a dos detalles, para producir algo debe iniciar varias veces, y segundo, la etapa de síntesis implica precisamente NO completar su forma cíclica. Si el GAP se emplea para hacer azúcares, no puede usarse para regenerar RuBP. Por lo tanto, la planta debe regular que tanto de GAP sigue la ruta para completar y expandir su ciclo de Calvin, y que tanto se emplea para fabricar azúcares.

Solo dos de las moléculas de GAP son empleadas para la síntesis de un azúcar de 6 carbonos como la glucosa, sin embargo, para que esta glucosa esté compuesta solo por carbonos externos a la planta, el ciclo debe iniciar 6 veces, para sí fijar 6 carbonos externos. La glucosa puede alterarse en sus isómeros por reacciones posteriores, como la fructosa. Posteriormente en el citoplasma de la célula, dos azúcares de 6 carbonos llamados glucosa y fructosa respectivamente se unen en un disacárido llamado sacarosa. Alternativamente varias moléculas de glucosa pueden unirse en un enorme polímero de almacenamiento llamado almidón, o sufrir alteraciones para generar grasas y otras sustancias necesarias para la célula.

Reacciones de oscuridad, y el flujo energético

La hemos examinado porque se lo denomina ciclo de Calvin, pero hay que analizar el segundo nombre de este tipo de reacciones "reacciones de la oscuridad o fase oscura" antes de pasar a describirlas con mayor detalle. Las reacciones de la luz que vimos anteriormente solo tienen dos posiciones de entrada de energía lumínica en el centro de cada uno de los dos fotosistemas, todas las demás reacciones se dan “cuesta abajo” en términos de energía. Las reacciones de oscuridad se denominan así porque a pesar de hacer parte de la fotosíntesis no tienen posiciones de entrada para la energía del Sol. El proceso es impulsado por productos químicos que provienen de las reacciones de la luz en forma de los portadores de energía llamados NADPH y ATP

Estas moléculas se emplean para impulsar la producción de glucosa y una molécula de 5 carbonos que ayuda a regenerar el ciclo de Calvin. En total para que el ciclo se complete una vez de manera efectiva se deben sacrificar 12 moléculas de NADPH y 18 moléculas de ATP  Este  gran gasto de energía refleja el hecho de que la molécula de dióxido de carbono es de baja energía “muy oxidada” y por lo tanto estable y difícil de manipular. El ciclo de Calvin puede darse en la noche siempre que la planta tenga suficiente NADPH y ATP almacenado de su labor diaria, pero en realidad puede ocurrir también en el día.

Alternativa al ciclo de Calvib-Benson

El ciclo del 3-hidroxipropionato es una de las pocas rutas metabólicas capaces de fijar dióxido de carbono inorgánico. Esta ruta metabólica fue descubierta en las bacterias verdes sulfurosas que emplean únicamente el fotosistema I como mecanismo para producir electrones de alta energía y ATP, específicamente en Chloroflexus aurantiacus, dado las fechas no es de extrañar que virtualmente ningún libro de texto posea referencia alguna a él, dejando la impresión de que la única ruta para la fijación de carbono es el ciclo de Calvin. De hecho, el texto que he empleado como base para los muchos artículos en este tema de fotosíntesis no tiene ninguna referencia a él. Una ruta metabólica altamente relacionadan puede encontrarse en las arcaicas acidofilas del filo Crenarqueota como Acidianus brierleyi, Sulfolobus metallicus y Metallosphaera sedula (Becerra, Rivas, García-Ferris, Lazcano, & Peretó, 2014; Caspi et al., 2014, 2016; Caspi, Dreher, & Karp, 2013; Ruvindy, White III, Neilan, & Burns, 2016).

Figura 21. Ciclo del 3-hidroxipropionato.

Cada giro del ciclo es capaz de fijar de manera neta dos moléculas de dióxido de carbono que se encuentra en forma de bicarbonato en una molécula de glicoxilato. El glicoxilato, que es una fuente de carbono poco convencional puede ser convertido a piruvato, un precursor universal de muchas rutas metabólicas “ejemplo, fermentaciones” mediante una ruta metabólica acoplada denominada asimilación de glocoxilato. Esta ruta metabólica comienza con la acetil-CoA la cual experimenta la carboxilación a malonil-CoA gracias a la catálisis de la acetil CoA carboxilasa. Posteriormente ocurren tres reacciones consecutivas de carga de energía. En la primera se sacrifica NADPH produciéndose malonato semialdehido; en la segunda se sacrifica otra molécula de NADPH produciéndose 3-hidroxipropionato y en la tercera se sacrifican dos grupos fosfato de una molécula de ATP para formar 3-hidroxipropanoil-CoA (Becerra et al., 2014; Caspi et al., 2014, 2016, 2013; Ruvindy et al., 2016).

En el siguiente paso ocurre una deshidratación y nuevamente dos reacciones consecutivas de carga de energía. En la primera se sacrifica otra molécula de NADPH para formar propanoil-CoA; posteriormente ocurre una nueva fijación de carbono junto con el sacrificio de un grupo fosfato de una nueva molécula de ATP para formar (s)-metilmalonil-CoA. Las siguientes dos reacciones son de reorganización molecular, la primera produciendo (R)-metilmalonil-CoA “ha ocurrido una isomerización” y posteriormente produciéndose Succinil-CoA la cual es ya una molécula conocida por otras rutas metabólicas como el ciclo de Krebs (Becerra et al., 2014; Caspi et al., 2014, 2016, 2013; Ruvindy et al., 2016).

La siguiente reacción requiere de la adición de (S)-Malato para dar dos productos importantes, el primero al igual que en el ciclo de Krebs es Succinato, y el segundo que sigue haciendo parte de la ruta se llama (S)-Malil-CoA. En el paso final la molécula de (S)-Malil-CoA es lisada para formar glioxilato y acetil-CoA para regenerar el sustrato inicial del ciclo. Un tema común que aparece cuando se examinan varias enzimas y moléculas de rutas metabólicas como la glucólisis, el ciclo de Krebs, el ciclo de Calvin, la ruta de las pentosas fosfato y el que se presenta aquí es el del reciclaje de reacciones, moléculas y enzimas para diferentes rutas (Becerra et al., 2014; Caspi et al., 2014, 2016, 2013; Ruvindy et al., 2016).